Кріоконсервація ембріонів для ЕКО

Сучасний розвиток медичних технологій сприяє розробці все нових підходів до лікування безпліддя. Так, широке застосування в клінічній практиці отримав один з методів репродуктивних допоміжних технологій - криоконсервация сперматозоїдів, ембріонів, ооцитів. У цій статті ми розглянемо новий сучасний вид підготовки до запліднення ембріонів або сперматозоїдів за допомогою глибокої заморозки рідким азотом.

Фото - Заморозка ембріонів для процедури ЕКО

Цей метод певною мірою сприяє вирішенню проблеми збереження та подальшого використання біологічного матеріалу, який залишається невикористаним під час проведення циклів запліднення in vitro. Адже при низьких температурах ембріони зберігаються в життєздатному стані, не порушується їх метаболічна активність, а ефективність використання, тобто рівень імплантації, не поступається програмам запліднення in vitro з використанням свіжих зразків біоматеріалу.

У світовій медичній практиці накопичений значний досвід досягнення вагітності шляхом розморожування і запліднення зрілих ооцитів. До недавнього часу як кріопротектор використовували реагент диметилсульфоксид (DMSO) і схему повільного охолодження і швидкого відтавання. Згодом стали застосовувати пропандіол (PROH), а потім - комбінацію пропандиола і сахарози, яка перетворилася на перший комерційний набір засобів для заморожування і відтавання ооцитів.

Проблеми заморожування клітин

Разом з тим, технологія заморожування клітин все ще недостатньо відпрацьована, а тому її вдосконалення залишається актуальною проблемою, яка потребує подальшого вирішення. Труднощі кріоконсервації зрілої яйцеклітини пов'язані:

- зі значним обсягом її цитоплазми;

- високим вмістом води в клітині;

- станом хромосом, що знаходяться в метафазі мейозу і дуже чутливих до температурних і осмотичних коливань при заморожуванні, і (що дуже важливо) відтаванні.

Основною причиною пошкодження клітин при заморожуванні і відтаванні є процес утворення кристалів льоду всередині клітини. Здавалося б, що зневоднення клітини може вирішити цю проблему, але видалення занадто великого обсягу води також вважається руйнівним для клітини.

Відомо, що температура замерзання води, в якій містяться різні іони, нижче 0 ° С і залежить від їх концентрації. При кріоконсервації клітини частина молекул води піддається кристалізації, яка підвищує концентрацію і тим самим знижує температуру заморожування.

Зростання в клітці рівня осмотичного тиску також має руйнівну дію. На сьогоднішній день однозначно доведено, що фактором ушкодження клітин є не низька температура, а кристали льоду, що утворюються в певних температурних зонах при заморожуванні і відтаванні.

Як відбувається процес заморожування клітин за допомогою кріотехнологій?

Процес глибокої заморозки матеріалу відбувається в основному двома способами:

1. Методом повільної кріоконсервації.

2. Методом незбалансованої кріоконсервації, яка складається з ультрашвидкий кріоконсервації і вітрифікації.

Метод повільної кріоконсервації, здійснюваний поетапно, найбільш поширений спосіб заморожування людських ембріонів. При повільному покроковому охолодженні відбувається дегідратація клітин, що сприяє зменшенню ризику утворення внутрішньоклітинних великих кристалів льоду.

Завдяки наявності осмотичного градієнта кріопротектори «витягують» з клітки воду, яка в міжклітинному просторі замерзає. З метою запобігання спонтанного утворення льоду застосовують ручний сідінг (seeding). Пінцетом торкаються до соломинку, які містять розчин з клітинами при температурі -6,5 ° С, з наступною десятихвилинної експозицією при температурі кристалізації.

Тому при температурі -35 ° С ембріони поміщають в рідкий азот, де проходить заключна стадія заморожування і де ембріони можуть зберігатися до використання.

Однак ризик пошкодження ембріонів внаслідок між- і внутрішньоклітинної кристалізації залишається досить великим. Крім того, метод повільної кріоконсервації здійснюється за допомогою спеціальної апаратури, вартість якої висока.

Методи заморозки ембріонів для підготовки до ЕКЗ

Метод ультрашвидкий кріоконсервації полягає в наступному. Ембріони, які перебували в розчині диметилсульфоксиду і сахарози, переносять в рідкий азот, дрібні кристали льоду, що утворюються згодом, тануть при більш низьких температурах.

Метод вітрифікації (від лат. Vitrum - скло) полягає в перетворенні рідини до твердого стану в результаті процесу екстремального підвищення в'язкості клітини при охолодженні, а не кристалізації, тобто вітрифікація - це заморожування без утворення кристалів льоду. При вітрифікації не тільки процес охолодження значно спрощується, а й зникає небезпека хімічних і фізичних пошкоджень, викликаних між- і внутрішньоклітинної кристалізацією.

Цей метод здійснюється за допомогою вітріфікаціонной рідини, яка складається з двох видів криопротекторов:

• розчину з високою концентрацією кріопротектори, здатного проникати крізь мембрану клітини (пропіленглюколь, гліцерин, етиленгліколь);

• розчину малопронікающего кріопротектори для забезпечення дегідратації клітин (поліетіленглюколь, фікол, сахароза).

Концентрація кріопротектори настільки висока, що при занадто швидкому охолодженні до -196 ° С в'язкість рідини сильно зростає.

Важливо, що для вітрифікації, на відміну від повільної кріоконсервації, застосовують одні й ті ж розчини, незалежно від стадії розвитку ооцитів або ембріонів. Практично процес вітрифікації полягає в розміщенні ооцитів або ембріонів в вітріфікаціонной середовищі, але на дуже короткий час з метою запобігання токсичного впливу внаслідок подальшого надшвидкого заморожування.

Таким чином, метод вітрифікації не вимагає значних матеріально-технічних витрат, і є зручним для практичного застосування. При вітрифікації значно спрощується процес охолодження, що запобігає розвитку фізичних і хімічних ушкоджень клітин внаслідок утворення між- і внутрішньоклітинних кристалів.

Як висновок, хочемо сказати, що вітрифікації в програмах екстракорпорального запліднення можна розглядати як альтернативу протоколу повільного заморожування. Сподіваємося, що в найближчому майбутньому буде однозначно доведено перевагу вітрифікації над повільним заморожуванням.